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Western blot 實驗注意事項

1. 配膠時，建議先加水， 再加Tris-HCL緩沖液，并且每加一種液體就混勻膠液。加入的TEMED有毒，務(wù)必在通風(fēng)櫥中操作， 并且加入后立即混勻、灌膠。丙烯酰胺未聚合的單體有神經(jīng)毒性， 能夠經(jīng)皮膚吸收， 需戴手套操作。

2. AP作為催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體聚合， TEMED作為加速劑能夠促進(jìn)AP釋放氧自由基，加速丙烯酰胺單體的聚合。空氣溫度較低時稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度，但要確保AP未變質(zhì)，否則無效。

3. AP應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用， 否則變質(zhì)會導(dǎo)致膠不聚合。另外， TEMED添加過量會使膠凝得過快并且孔徑大小不一，影響蛋白的電泳，甚至可能燒膠。

4. 電泳內(nèi)槽中應(yīng)加入新鮮的電泳液， 并且應(yīng)先拔梳子再安裝入電泳槽， 添加電泳液。這樣能夠沖洗掉各孔中碎膠， 確保電泳時條帶平直。

5. 建議兩邊加入預(yù)染的Protein Marker，方便觀察不同KDa蛋白的分離情況，也方便后續(xù)的裁膜。

6. 電轉(zhuǎn)液中一般需加入甲醇或乙醇， 而電轉(zhuǎn)時的放熱會加速醇類的揮發(fā)進(jìn)而影響下一次重復(fù)使用時的電轉(zhuǎn)效果。重復(fù)使用電轉(zhuǎn)液時應(yīng)考慮到醇類的揮發(fā)而適當(dāng)延長電轉(zhuǎn)時間， 最好是每次電轉(zhuǎn)時都使用新的電轉(zhuǎn)液。不同KDa的蛋白電轉(zhuǎn)的條件不同， 所以可以針對目的蛋白進(jìn)行切膠， 然后在不同條件下電轉(zhuǎn)。

7. 蓋上PVDF膜后， 不要再輕易移動， 否則條帶會模糊。兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路，蛋白會轉(zhuǎn)不過來。

8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA，建議建議做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白） 作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶， 磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化， 用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響。

9. 一抗在四度孵育時能夠延緩抗體的衰減速度， 提高重復(fù)利用的次數(shù)。建議嚴(yán)格按照要求進(jìn)行洗膜， 不要輕易減少洗膜的次數(shù)和時間。Tween20作為一種非離子表面活性劑， 能夠減少非特異性的抗體結(jié)合， 降低背景。所以如果曝光后發(fā)現(xiàn)背景高，可以將1XPBST/TBST中Tween20從0.05%提高到0.5%，并且增加洗膜次數(shù)。

10. 曝光時盡量將目標(biāo)蛋白和內(nèi)參一起曝光， 便于比較。如果使用傳統(tǒng)的壓片曝光， 可以壓兩張甚至更多的片子并折角， 折角可以確定方向， 增加壓片數(shù)量可以控制曝光強度。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況， 離膜遠(yuǎn)的蛋白可以保證亮度強的蛋白不過曝。

11. 曝光時多使用ECL發(fā)光試劑盒， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度， 而內(nèi)參等含量較多的蛋白則應(yīng)使用普通的ECL發(fā)光試劑防止過亮，阻礙曝光。

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